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啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力測定

來源:www.mqwn.com.cn???時間:2022-05-29 18:02???點擊:232??編輯:admin 手機版

啤酒酵母里蔗糖酶的提取和活力測定原理
  1、細胞破壁:就酶在生物體內的分布,可分為胞內酶和胞外酶,蔗糖酶系胞內酶。提取胞內酶時,要破碎組織和細胞,然后用一定的溶液提取,得到的材料稱為無細胞抽提液。材料不同,破壁的方法也不同。我們用的菌體(微生物)細胞破壁方法是:自溶法,即將菌體放在適當的pH值和溫度下,利用組織細胞自身的酶系將細胞壁破壞,使細胞內的物質釋放出來。自溶時需加少量防腐劑,以防外界細菌污染。自溶法的缺點是時間較長。
  2、3,5-二硝基水楊酸比色定糖的原理
  (1)DNS試劑+ D-葡萄糖 氨基化合物
  (還原糖) (棕紅色)
  (2)在一定范圍內還原糖的量與反應液的顏色強度成一定比例關系(可用于比色測定),所以可用DNS比色法測定還原糖的含量。
  (3)該方法是半微量定糖法,操作簡便、快速、雜質干擾較少。
  試劑與器材
  恒溫水浴、自動部分收集器、恒溫箱、梯度洗脫裝置、冰箱、層析柱、分析天平、電磁攪拌器、秒表、離心機、可見分光光度計、凍干機、沸水浴等。3,5二硝基水楊酸試劑(DNS)、5%的蔗糖溶液、1mol/L的 NaOH溶液、乙酸鈉、0.2mol/L,pH4.6的醋酸緩沖液 6. 乙酸乙酯

  操作方法
  ① 細胞破壁→抽提→兩次乙醇分級→透析→裝柱→洗滌→洗脫→收集酶活力峰→制凍干粉
  ② 制作3,5—二硝基水楊酸比色定糖法的標準曲線并測定三種酶樣品的活力
  ③ 測定三種酶樣品的蛋白濃度
  ④ 計算各步酶樣的比活力、提純倍數和收率
  ⑤ 用雙倒數作圖法測定蔗糖酶的Km值
  關鍵步驟與注意事項
  ① 乙醇分級時,注意低溫、防止乙醇局部過濃,離心后要迅速溶解酶樣
  ② 裝柱均勻,無截面、無氣泡,床面平整,柱體垂直
  ③ 分離提純的全過程中,防止酶失活并用測定酶活力的方法跟蹤酶的去向
  ④ 在測定米氏常數時,將酶樣溶解后一定要稀釋到合適的濃度。
  ⑤ 酶活力測定及作圖一定要準確。

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